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摘要 目的 构建3D打印皮肤成体干细胞来源类器官人工皮肤并探讨其修复小鼠皮肤缺损的效果。
方法 将人皮肤角质形成细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞以2∶1∶1制备细胞混合悬液，在超低吸附培养板中培养，倒置相差显微镜观察细胞球的形态变化。培养7 d后收集细胞球，进行免疫荧光染色，检测其真皮、表皮及血管标志物的表达情况及结构分布情况。采用3D打印技术打印类器官人工皮肤，观察打印出的人工皮肤的形态。将10只免疫缺陷balb/c雌性小鼠按随机数字表法分为水凝胶组和类器官组，每组5只。所有小鼠建立直径1 cm的全层皮肤缺损模型，水凝胶组创面覆盖水凝胶敷料，类器官组创面覆盖相同大小类器官人工皮肤。建模后0、4、8、12及16 d观察两组创面愈合大体情况及创面愈合率。建模后16 d时创面皮肤取材，HE染色观察创面表皮角化情况及表皮真皮连接情况，Masson染色观察创面胶原纤维的疏松致密程度及真皮层纤维厚度。
结果 （1）角质形成细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的细胞混合悬液在超低吸附培养板中可自聚集形成细胞球；倒置显微镜观察显示，随着培养时间延长，细胞球体积逐渐增大。（2）细胞球免疫荧光染色结果显示，细胞球外层表达表皮标志物如角蛋白（K）1、K10及K14，核心表达真皮标志物如波形蛋白（VIM）及血管标志物CD31，即表皮位于球体的外层，真皮和血管位于球体的中央，符合皮肤类器官的结构特点。（3）3D打印出的类器官人工皮肤呈圆形透明状，直径10 mm，厚度1 mm。（4）小鼠创面大体观察结果显示，两组小鼠创面面积随治疗时间延长均有缩小，类器官组创面愈合速度更快，建模后4 d时即出现明显上皮化，16 d时创面基本愈合。建模后0 d时，两组创面外观无差异；建模后4、8 d时类器官组创面愈合率分别为（31. 7±1. 0）%、（52. 4±5. 4）%，水凝胶组分别为（24. 3±6. 8）%、（45. 4±7. 0）%（P>0. 05）；建模后12、16 d时类器官组创面愈合率分别为（78. 6±8. 0）%、（91. 1±5. 6）%，水凝胶组分别为（58. 5±5. 4）%、（71. 9±7. 8）%（P<0. 01）。（5）创面皮肤HE染色结果显示，类器官组表皮角化更好，表皮层更完整，表皮与真皮贴附良好，连接紧密；水凝胶组表皮角化不全且表皮与真皮明显分离。Masson染色结果显示，两组创面真皮层均由胶原纤维结构生成，呈蓝色网状结构， 但类器官组创面胶原纤维结构更加致密，真皮层纤维厚度更小；而水凝胶组胶原纤维结构松散，真皮层胶原纤维厚度更大。
结论 皮肤成体干细胞在3D培养条件下可形成皮肤类器官，并利用3D生物打印技术构建类器官人工皮肤。与水凝胶敷料相比，类器官人工皮肤可明显提高小鼠皮肤缺损创面愈合速率，创面表皮角化程度更好，表皮与真皮连接更紧密，并且创面胶原纤维结构更加致密，真皮层纤维厚度更小。
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