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摘要 目的 探讨基于软骨脱细胞外基质微载体体外构建具有功能化和自我更新能力的软骨类器官。
方法 取新鲜的猪关节软骨，将部分仅粉碎处理的软骨微粒设置为天然软骨组；利用物理离心化学萃取相结合的脱细胞方法，制备粒径合适的细胞外基质（ECM）微载体，设置为微载体组。通过旋转式生物反应器将人脐带干间充质干细胞（hUCMSC）和人软骨细胞（hCho）按照3∶1的比例与微载体负载，体外构建软骨类器官，将诱导不同时间的类器官分为诱导0、7、14 及21 d 组。4′，6‐二脒基‐2‐苯基吲哚（DAPI）荧光染色观察、DNA定量评估微载体组和天然软骨组细胞残留情况；番红O、甲苯胺蓝染色观察微载体ECM保留情况，二甲氨基苯甲醛比色法测定微载体组和天然软骨组胶原蛋白含量；二甲基亚甲蓝（DMMB）比色法测定微载体组和天然软骨组糖胺聚糖（GAGs）含量。扫描电镜及能谱分析对微载体进行进一步表征；将添加体积分数10%胎牛血清（FBS）的杜尔伯克改良伊戈尔低糖培养基（DMEM）培养的hUCMSC作为对照组，将微载体浸提液培养的hUCMSC作为实验组，两组分别设置培养1、3、5 d共3个时间点的亚组，细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK‐8）检测两组生物相容性。活死染色检测诱导0、7、14及21 d组的软骨类器官细胞活性，Ki67荧光染色鉴定诱导14 d软骨类器官的自我更新能力。RT‐PCR测定诱导7、14和21 d组的软骨类器官，包括软骨形成相关标记物聚蛋白聚糖（ACAN）、Ⅱ型胶原（COL2A1）、性别决定区Y框蛋白9（SOX9）及软骨肥大、矿化相关标记物Ⅰ型胶原（COL1A1）、Runt 相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）的表达水平；比色法和DMMB法测定诱导0、7、14及21 d组的类器官分泌胶原蛋白和GAGs能力。
结果 DAPI荧光染色结果显示，天然软骨组具有大量细胞核，而微载体组则基本无细胞核。微载体组DNA含量为（7. 8±1. 8）ng/mg，较天然软骨组的（526. 7±14. 7）ng/mg显著降低（P<0. 01）。番红O、甲苯胺蓝染色可见微载体着色较深且均一，保留大量软骨ECM 成分。微载体组胶原蛋白含量为（252. 9±1. 4）μg/mg，GAGs 含量为（173. 4±0. 8）μg/mg，均显著低于天然软骨组的（311. 9±2. 2）μg/mg、（241. 3±0. 7）μg/mg（P<0. 01）。扫描电镜显示，微载体表面有凹凸不平相互交错的胶原纤维网络。能谱分析结果显示，C、O、N元素均匀分布在微载体，表明该微载体成分组成均匀。微载体生物相容性良好，培养1、3 d时，对照组、实验组CCK‐8实验结果比较，差异均无统计学意义（P>0. 05）；培养5 d，实验组A 值为0. 53±0. 02，优于对照组的0. 44±0. 03（P<0. 05）。诱导0、7、14及21 d组中，hUCMSC和hCho贴附在微载体表面且细胞活性好，活死比例分别为（70. 6±1. 1）%、（80. 5±0. 6）%、（94. 5±0. 9）%、（90. 8±0. 5）%（P<0. 01）；诱导14 d时，软骨类器官有大量Ki67阳性细胞。RT‐PCR显示，诱导7 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为1. 00±0. 09、1. 00±0. 24、1. 00±0. 18、1. 00±0. 03、1. 00±0. 06、1. 00±0. 13；诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN 表达水平分别为4. 16±0. 28、5. 09±1. 25、5. 65±1. 05、0. 47±0. 01、1. 68±0. 02、0. 21±0. 06；诱导21 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为13. 42±0. 92、3. 07±0. 21、1. 84±1. 08、2. 72±0. 17、2. 91±0. 18、3. 32±1. 20。与诱导7 d组比较，诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、RUNX2表达水平均升高（P<0. 05），COL1A1表达水平降低（P<0. 05），OCN表达水平差异无统计学意义（P>0. 05）；与诱导7 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2表达水平均显著升高（P<0. 01），COL2A1、SOX9、OCN表达水平差异均无统计学意义（P>0. 05）；与诱导14 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平均升高（P<0. 05或0. 01），COL2A1 表达水平差异无统计学意义（P>0. 05），SOX9 表达水平降低（P<0. 05）。诱导0、7、14及21 d组胶原蛋白含量分别为（219. 15±0. 48）μg/mg、（264. 07±1. 58）μg/mg、（270. 83±0. 84）μg/mg、（280. 01±0. 48）μg/mg，GAGs含量分别为（171. 18±1. 09）μg/mg、（184. 06±1. 37）μg/mg、（241. 08±0. 84）μg/mg、（201. 14±0. 17）μg/mg。与诱导0 d组比较，诱导7、14、21 d组胶原蛋白和GAGs含量均显著升高（P<0. 01）。在诱导7、14、21 d组中，诱导7 d组胶原蛋白含量最低（P<0. 01），诱导21 d组胶原蛋白含量最高（P<0. 01）；诱导7 d组GAGs含量最低（P<0. 01），诱导14 d组GAGs含量最高（P<0. 01）。
结论 物理化学方法结合制备的微载体脱细胞成功，其基质保留较多，成分均一且无细胞毒性。基于微载体负载hHUMSC与hCho体外成功构建软骨类器官，具有细胞活性好、自我更新能力、软骨形成相关基因表达强及分泌胶原蛋白和GAGs等特点，诱导14 d时构建的软骨类器官成软骨活性最佳。
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