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摘要 目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)分泌的外泌体对损伤后肌腱细胞修复的影响及其机制。 方法 组织块贴壁法分离并纯化筛选出能稳定传代培养的hUC-MSCs,倒置荧光显微镜观察细胞形态,通过流式细胞术检测hUC-MSCs的免疫表型。应用诱导培养基诱导hUC-MSCs向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化并进行鉴定。运用高速离心法提取MSCs的分泌物外泌体(MSCs外泌体),用Western blot技术和电镜检测外泌体,用PKH67染色荧光法检测外泌体膜融合能力。40只Wistar鼠按随机数字表法分为肌腱损伤组和正常组,每组20只。肌腱损伤组:切断跟腱1周后用100 mg/kg戊巴比妥钠处死,取跟腱组织用胰蛋白酶消化得到损伤肌腱细胞。正常组:不做任何处理直接处死,与损伤组并行处理得到正常肌腱细胞。将外泌体与体外培养的肌腱细胞共培养,12,24,48,72 h后通过细胞计数CCK-8检测肌腱细胞增殖情况。hUC-MSCs外泌体处理细胞24 h后,采用Western blot、qPCR、免疫荧光方法检测外泌体对肌腱细胞转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。 结果 鉴定了hUC-MSCs,并成功分离hUC-MSCs外泌体。分离培养的MSCs 呈梭形,丙氨酸氨肽酶(CD13)、整联蛋白β-1(CD29)、ecto-5'-核苷酸酶(CD73)、胸腺细胞表面抗原(CD90)和内皮素(CD105)呈阳性,人类白细胞DR抗原(HLA-DR)、造血祖细胞抗原(CD34)、白细胞共同抗原(CD45)呈阴性。分离出的外泌体经PKH67染色鉴定证实,在电镜下呈直径30~100 nm的圆盘、内部凹陷结构,Western blot检测高表达移动相关蛋白-1(CD9)和溶酶体相关膜蛋白3(CD63)。处理肌腱细胞后,CCK-8检测12,24,48,72 h细胞活性,结果表明肌腱损伤组显著高于正常组(P < 0. 01),qPCR 结果表明肌腱损伤组TGF-β(1. 850 ± 0. 127)、BMP(2. 133 ±0. 398)、FGF(1. 610 ± 0. 223)、VEGF(2. 207 ± 0. 059)的mRNA表达显著高于正常组TGF-β(1. 004 ±0. 105)、BMP(1. 007 ± 0. 145)、FGF(1. 007 ± 0. 140)、VEGF(1. 001 ± 0. 065)(P < 0. 05),而肌腱损伤组IL-1β(0. 102 ± 0. 009)、TNF-α(0. 130 ± 0. 013)的表达显著低于正常组IL-1β(1. 004 ± 0. 113)、TNF-α(1. 006 ± 0. 134)(P < 0. 01)。Western blot检测结果与qPCR检测趋势一致。 结论 hUC-MSCs分泌的外泌体通过上调生长因子TGF-β、BMP、VEGF、FGF的表达,抑制炎性因子IL-1β、TNF-α的表达,促进肌腱细胞生长,促进肌腱细胞损伤修复。
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