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摘要 目的 构建丝素蛋白（SF）、细菌纤维素（BCNR）、羟基磷灰石（HAp）复合骨再生支架并评价其促成骨活性的价值。
方法 将HAp颗粒、BCNR和骨形态发生蛋白2（BMP2）依次加入SF水溶液中，搅拌均匀后倒入不同大小的模具，-25 ℃下处理24 h，冷冻成型，通过冻干机将复合支架冻干。将SF与BCNR不同质量比的复合支架设置为A组（2∶1）、B组（4∶1）、C组（6∶1），将未加入BMP2的无活性复合支架设置为D组。扫描电镜检测支架的表面形貌和孔隙结构；压汞仪检测支架的孔隙率；万能材料试验机压缩支架，获得应力‑应变曲线，分析支架的压缩强度和杨氏模量。将永生化小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）接种到A组、B组、C组及D组复合支架上。细胞接种4、8 d后，细胞活/死染色检测各组活细胞和死细胞比例；细胞计数试剂盒 8（CCK‑8）实验检测各组细胞的增殖活性；碱性磷酸酶（ALP）染色检测各组染色阳性细胞；ALP活性检测观察各组细胞的ALP活性。选取15只雌性SD大鼠，构建大鼠肌袋异位成骨模型，植入不同SF与BCNR质量比的复合支架及未加入BMP2的无活性复合支架，分别为A′组（2∶1）、B′组（4∶1）、C′组（6∶1）和D′组，另设假手术组，每组3只。假手术组在切开皮肤、钝性分离股四头肌肌肉，于肌肉中形成肌袋后，仅缝合肌袋及皮肤，不植入支架，其他四组在肌袋内植入对应的支架，并缝合肌袋及皮肤。术后2、4周行X线片检查，观察各组骨形成情况。术后4周，收集植入的支架与组织复合物，进行病理组织切片、HE染色和Masson 染色，观察各组成骨情况。另对组织切片进行免疫组化染色，观察各组成骨标志物Ⅰ型胶原蛋白（COL1）和骨桥蛋白（OPN）的表达情况。
结果 扫描电镜显示，相较于A组和C组，B组片层结构和微孔结构更加规则、均匀；孔隙率分析结果表明，B 组和 C 组孔隙率分别为（89. 752±1. 866）%和（84. 257±1. 013）%，均高于 A 组的（81. 171±1. 268）%（P<0. 05或0. 01），而C组孔隙率低于B组（P<0. 01）。力学性能检测结果显示，B组和C组压缩强度分别为（0. 373±0. 009）MPa和（0. 403±0. 017）MPa，均高于A组的（0. 044±0. 003）MPa（P<0. 01），B 组和 C 组杨氏模量分别为（7. 413±0. 094）MPa 和（9. 515±0. 615）MPa，均高于 A 组的（1. 881±0. 036）MPa（P<0. 01），而C组压缩强度和杨氏模量均高于B组（P<0. 05或0. 01）。细胞活/死染色结果显示，细胞接种4 d后，B组死细胞明显少于A组、C组和D组；细胞接种8 d后，B组活细胞最多，死细胞最少。CCK‑8 实验结果显示，细胞接种 4 d 后，A 组和 B 组细胞增殖活性分别为 0.474±0.009和0.545±0.018，均高于D组的0.394±0.016（P<0.01），C组细胞增殖活性为0.419±0.005，与D组差异无统计学意义（P>0.05），而A组和C组细胞增殖活性均低于B组（P<0.01）；细胞接种8 d后，B组细胞增殖活性为1. 290±0. 021，高于D组的1. 047±0. 011（P<0. 01），C组细胞增殖活性为0.794±0.032，低于D组（P<0.01），A组细胞增殖活性为1.086±0.020，与D组差异无统计学意义（P>0.05），而 A 组和 C 组细胞增殖活性均低于 B 组（P<0. 01）。ALP 染色结果显示，细胞接种 4、8 d 后，相较于 D组，A组、B组和C组有更多的阳性细胞，B组阳性细胞多于A组和C组。ALP活性检测结果显示，细胞接种4 d后，A组、B组和C组细胞ALP活性分别为1. 399±0. 071、1. 934±0. 011、1. 565±0. 034，均高于D组的0. 082±0. 003（P<0. 01），而A组和C组细胞ALP活性均低于B组（P<0. 01）；细胞接种8 d后，A组、B组和 C组细胞 ALP活性分别为 2. 602±0. 055、3. 216±0. 092、2. 145±0. 170，均高于 D组的0. 101±0. 001（P<0. 01），而A组和C组细胞ALP活性均低于B组（P<0. 01）。X线片检查结果显示，术后2周，假手术组、D′组、A′组和C′组均无明显骨形成，而B′组有明显骨形成；术后4周，A′组、B′组和C′组均有明显骨形成，B′组骨形成明显多于其他两组，而假手术组和D′组均无明显骨形成。HE染色和Masson染色结果显示，术后4周，B′组形成大量均匀分布的新生骨组织，而A′组和C′组只在局部有少量新生骨组织，D′组仅有部分组织长入，且无明显新生骨组织，B′组形成的新生骨组织的成熟度比A′组和C′组更高。免疫组化染色结果显示，B′组COL1和OPN阳性染色均较A′组和C′组更多。COL1 和 OPN 表达强度分析结果显示，A′组、B′组和 C′组 COL1 表达强度分别为 2. 822±0. 384、22. 810±2. 435、12. 480±0. 912，OPN表达强度分别为1. 545±0. 081、5. 374±0. 121、2. 246±0. 116，B′组和C′组COL1、OPN表达强度均高于A′组（P<0. 01），而C′组COL1和OPN表达强度均低于B′组（P<0. 01）。
结论 基于SF、BCNR和HAp成功构建复合骨再生支架，其中SF和BCNR质量比为4∶1的复合支架具有均匀孔隙结构、高孔隙率、良好的力学性能和生物相容性、优异的体外促成骨性能，还具有优异的骨诱导性和骨传导性。
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