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力生长因子对破骨细胞活性的影响及其机制 |
佟雁翔 王斌 贾燕飞 冯卫 张立峰 李亚光 薛飞 于成涌 张哲汉 王文选 贾文超 王祎 杨又玮 |
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摘要 目的 探讨力生长因子(MGF)对破骨细胞活性的影响及其机制。 方法 使用诱导剂25 ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子(M⁃CSF)及30 ng/ml 核因子⁃κB 受体活化因子配体(RANKL)对RAW264. 7前体破骨细胞系进行诱导培养,培养7 d后通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法进行鉴定。取培养的破骨细胞,采用Western blot法测定45 ng/ml的MGF对破骨细胞中磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路及其活性的影响,即AKT、磷酸化(p)⁃AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p⁃mTOR和TRAP在0,4,8和12 h的表达水平,同时采用RT-PCR法从分子水平测定破骨细胞TRAP 在0,4,8 和12 h 的表达水平。用20 μmol/L PI3K/AKT 磷酸化抑制剂LY294002 联合45 ng/ml MGF作用于破骨细胞,采用Western blot法检测AKT、p⁃AKT、mTOR、p⁃mTOR和TRAP在0,4,8和12 h的表达水平。 结果 M⁃CSF和RANKL对RAW264. 7细胞培养7 d后,能够得到大量TRAP染色阳性的破骨细胞。Western blot结果显示,MGF 作用于破骨细胞后,AKT和mTOR的表达水平随作用时间无明显变化(P>0. 05),p⁃AKT和p⁃mTOR的表达水平随着作用时间的延长持续增高,分别由0 h 的(2. 18±0. 34)pg/ml 和(0. 83±0. 10)pg/ml 增加至12 h 的(3. 86±0. 36)pg/ml 和(1. 56±0. 19)pg/ml(P<0. 05),TRAP 的表达水平随作用时间显著降低,由0 h 的(5. 66±0. 47)pg/ml 降至12 h 的(3. 76±0. 38)pg/ml(P<0. 05)。RT-PCR法测定破骨细胞TRAP表达结果显示,MGF抑制破骨细胞TRAP的表达,由0 h的1. 02±0. 06降至12 h的0. 53±0. 11(P<0. 05)。Western blot结果显示,LY294002联合MGF作用于破骨细胞后,AKT和mTOR的表达水平随作用时间无明显变化(P>0. 05),p⁃AKT和p⁃mTOR的表达水平显著降低,分别由0 h的(3. 28±0. 18)pg/ml和(3. 29±0. 22)pg/ml降至12 h的(2. 06±0. 34)pg/ml和(2. 04±0. 20)pg/ml(P<0. 05),而TRAP的表达水平随MGF作用时间则差异无统计学意义(P>0. 05)。 结论 MGF 通过PI3K/AKT 信号途径抑制破骨细胞TRAP 的表达,进而抑制破骨细胞活性;LY294002抑制破骨细胞PI3K/AKT信号通路的表达,进一步验证MGF抑制破骨细胞活性的机制。这一发现可为临床预防及治疗骨质疏松症提供新的思路。
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