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摘要 目的 探讨低浓度脓毒症血清预处理周细胞增强脓毒症血管屏障功能的作用及其可能机制。
方法 选取140只健康SD大鼠（雌雄比例各半）。（1）体外实验：取20只大鼠构建脓毒症模型，12 h后腹主动脉采血并提取血清。将脓毒症大鼠血清与杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F12（DMEM/F12）按照1∶100、5∶100和10∶100配成脓毒症大鼠血清体积分数为1%、5%、10%的条件培养基，分别用不同浓度脓毒症血清培养基对正常周细胞进行体外预处理12 h，同时设置未预处理周细胞作为对照。采用划痕和Transwell实验观察不同浓度脓毒症血清预处理周细胞迁移率和跨膜迁移数量，筛选出脓毒症血清最佳预处理浓度。（2）体内实验：另将120只大鼠按随机数字表法分为5组：假手术组、脓毒症组、常规治疗组（治疗Ⅰ组）、常规治疗+正常周细胞治疗组（治疗Ⅱ组）、常规治疗+最佳体积分数脓毒症大鼠血清预处理周细胞治疗组（治疗Ⅲ组），每组24只。假手术组只进行禁食和开关腹处理，不进行盲肠结扎和穿孔；脓毒症组在模型建立后不作任何处理；治疗Ⅰ组构建脓毒症模型12 h后进行常规液体复苏治疗；治疗Ⅱ组和治疗Ⅲ组在常规治疗的基础上分别经股静脉注射周细胞（106个/只）和最佳脓毒症血清浓度预处理周细胞（106个/只）。治疗24 h后，采用免疫荧光法、流式细胞术观察治疗Ⅱ组和治疗Ⅲ组肠道周细胞定植数量；利用异硫氰酸荧光素⁃牛血清白蛋白（FITC⁃BSA）渗漏观察各组注射FITC⁃BSA后5 min时肠系膜微血管FITC⁃BSA渗漏率情况；采用激光多普勒血流灌注成像仪观察肠、肝和肾血流灌注量；通过HE染色观察组织病理及肠Chiu′s标准分级。观察脓毒症大鼠治疗72 h后的存活率和存活时长。（3）分子机制分析：采用液相色谱⁃串联质谱（LC/MS⁃MS）技术对未处理周细胞和最佳浓度脓毒症血清预处理周细胞进行非靶向蛋白组学检测，通过对测序结果进行筛选，获得差异蛋白，然后进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，并用Western blot法对迁移通路相关蛋白相对表达水平进行检测。
结果 （1）体外实验：治疗24 h后，体积分数1%脓毒症血清预处理周细胞迁移率高于未预处理周细胞及体积分数5%、10%脓毒症血清预处理周细胞（P<0.05）；体积分数1%脓毒症血清预处理周细胞跨膜迁移细胞数量高于未预处理周细胞及体积分数5%、10%脓毒症血清预处理周细胞（P<0.05）；根据周细胞迁移率和跨膜迁移细胞数量结果，筛选得出脓毒症血清预处理周细胞最佳体积分数为1%。（2）体内实验：治疗24 h后，免疫荧光结果显示，治疗Ⅲ组肠组织周细胞定植数量较治疗Ⅱ组多（P<0.01）；流式细胞术结果同样显示，治疗Ⅲ组肠组织周细胞定植数量较治疗Ⅱ组多（P<0.01）。FITC⁃BSA 渗漏结果显示，注射FITC⁃BSA 5 min 后，治疗Ⅲ组FITC⁃BSA渗漏率较治疗Ⅱ组、治疗Ⅰ组和脓毒症组低（P<0.05），较假手术组高（P<0.05）。激光多普勒血流灌注成像结果显示，治疗Ⅲ组肠、肝、肾血流灌注量均较治疗Ⅱ组、治疗Ⅰ组和脓毒症组高，较假手术组低（P<0.05）。治疗24 h后，HE染色结果显示，假手术组肠组织形态正常，小肠绒毛完整，排列整齐，长度均匀；脓毒症组小肠绒毛及固有层脱落，部分绒毛顶端脱落，绒毛杂乱倒伏，炎症浸润明显；治疗Ⅰ组肠绒毛杂乱，肠道组织水肿，炎症浸润；治疗Ⅱ组肠绒毛整齐、长度增加、绒毛纤细，肠组织炎症浸润改善；治疗Ⅲ组小肠绒毛较为完整，绒毛顶端几乎无脱落，绒毛整齐，肠组织状态接近于假手术组；治疗Ⅲ组肠Chiu′s标准分级较治疗Ⅱ组、治疗Ⅰ组和脓毒症组低，较假手术组高（P<0.05）。治疗72 h后，治疗Ⅲ组存活率和存活时长均较治疗Ⅱ组、治疗Ⅰ组和脓毒症组高或长（P<0.05），较假手术组差异无统计学意义（P>0.05）。（3）分子机制：非靶向蛋白组学KEGG富集分析结果显示，与未预处理周细胞组相比，体积分数1%脓毒症血清预处理周细胞组磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路明显富集（富集率为0.13，P<0.05），且磷酸化PI3K（p⁃PI3K）和磷酸化AKT（p⁃AKT）蛋白相对表达水平均高于未预处理周细胞组（P<0.05）。
结论 体积分数1%脓毒症血清是预处理周细胞的最佳浓度。低浓度脓毒症血清预处理周细胞主要通过激活PI3K/AKT信号通路来增强周细胞的迁移能力和体内定植能力，并增强脓毒症血管屏障功能。
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