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摘要 目的 探讨三维真皮毛乳头细胞外囊泡（tdDPC⁃EV）对糖尿病小鼠创面愈合的作用
及其机制。 方法 采用自饲养层三维培养体系重编程原代真皮毛乳头细胞（DPC），获得tdDPC，提取
tdDPC⁃EV并通过透射电镜、纳米流式技术鉴定其表征。取10只瘦素受体缺陷小鼠，每只小鼠双侧背
部对称制作2个圆形全层皮肤缺损创面模型。按随机数字表法将小鼠分为磷酸盐缓冲液（PBS）组和
tdDPC⁃EV组，每组5只，每间隔1 d分别给予PBS（100 μl）及等量tdDPC⁃EV治疗2周。于造模后0、7、
14、21 d拍摄小鼠创面照片并计算剩余创面面积；于造模后7、14 d通过激光多普勒检测创周血流量；
于造模21 d后收集小鼠皮肤组织进行病理切片并进行HE、Masson、分化簇（CD）31染色，评估创面愈合
效果。取第3代人脐静脉内皮细胞（HUVEC），按随机数字表法分为对照组、高糖组、高糖+囊泡组，并
分别采用正常糖、高糖添加PBS、高糖添加tdDPC⁃EV培养48 h。采用衰老相关β⁃半乳糖苷酶（SA⁃β⁃gal）
染色试剂盒检测3组细胞SA⁃β⁃gal活性；管腔形成实验检测3组细胞管腔形成能力；ELISA法分别检
测3 组细胞上清液衰老相关分泌表型（SASP）因子［白细胞介素（IL）⁃1α、IL⁃6、IL⁃8］表达情况；
qRT⁃PCR法检测3组细胞衰老标志物（P16、P21、P53）表达情况；8⁃羟基⁃2⁃脱氧鸟苷（8⁃OHdG）ELISA
检测试剂盒检测3组细胞氧化应激损伤情况。取高糖组及高糖+囊泡组处理48 h的HUVEC进行转
录组测序筛选显著性差异基因，并通过qRT⁃PCR和Western blot法对差异基因表达水平进行验测。
构建Krüppel 样因子4（KLF4）敲低及过表达的慢病毒对高糖处理的HUVEC 分别感染48 h，得到
KLF4敲低和KLF4过表达的高糖HUVCE，将细胞分为对照组（高糖HUVEC添加20 μg/ml PBS）、囊泡
组（高糖HUVEC 添加20 μg/ml tdDPC⁃EV）、KLF4 敲低组（KLF4 敲低的高糖HUVEC 添加20 μg/ml
tdDPC⁃EV）、KLF4 过表达组（KLF4 过表达的高糖HUVEC 添加20 μg/ml PBS）。处理48 h 后，采用
Western blot法检测4组细胞KLF4、血管内皮生长因子A（VEGFA）蛋白表达水平；分别采用SA⁃β⁃gal
染色试剂盒、管腔形成实验、ELISA法及qRT⁃PCR检测4组HUVEC的SA⁃β⁃gal活性，管腔形成能力、
SASP因子（IL⁃1α、IL⁃6、IL⁃8）表达水平及衰老标志物（P16、P21、P53）表达水平。双荧光素酶报告基因
实验检测KLF4与VEGFA的相互作用关系。 结果 透视下自饲养层三维培养72 h的tdDPC呈立体球
状聚集，tdDPC⁃EV为典型盘状囊泡，纳米流式检测粒径符合囊泡标准。与PBS组比较，tdDPC⁃EV组
造模后7、14 d 剩余创面积减小，以及创周血流量升高（P<0.01）。与PBS组比较，tdDPC⁃EV组造模
21 d后皮肤组织HE染色结果显示皮肤结构恢复良好；Masson染色结果显示纤维排列正常，胶原沉积
稳定；CD31染色结果显示CD31阳性密度增加2.76倍。各组细胞培养48 h后，与对照组比较，高糖组
SA⁃β⁃gal阳性细胞增多，管腔形成减少（P<0.01）。与高糖组比较，高糖+囊泡组SA⁃β⁃gal阳性细胞减
少，管腔形成增多（P<0.01）；与对照组比较，高糖组IL⁃1α、IL⁃6、IL⁃8表达水平、细胞衰老标志物P16、
P21、P53表达水平、8⁃OHdG表达水平增高（P<0.01），与高糖组比较，高糖+囊泡组IL⁃1α、IL⁃6、IL⁃8表
达水平，P16、P21、P53和8⁃OHdG表达水平降低（P<0.01）。2组细胞处理48 h后，转录组测序结果显
示，与高糖组比较，高糖+囊泡组处理后HUVEC的KLF4及VEGFA基因表达上调（P<0.01）；qRT⁃PCR
及Western blot法结果显示，与PBS组比较，tdDPC⁃EV组HUVEC的KLF4及VEGFA基因表达水平及蛋
白表达水平均上调（P<0.01）。4组细胞处理48 h后，Western blot法结果显示，与对照组比较，囊泡组
及KLF4过表达组KLF4及VEGFA蛋白表达均升高（P<0.01），与KLF4敲低组比较，囊泡组及KLF4过表达组KLF4及VEGFA蛋白表达水平均升高（P<0.01）；SA⁃β⁃gal染色结果显示，与对照组比较，囊泡
组及KLF4过表达组SA⁃β⁃gal均减弱（P<0.01），与KLF4敲低组比较，KLF4过表达组及囊泡组SA⁃β⁃gal
均减弱（P<0.01）；管腔形成实验结果显示，与对照组比较，囊泡组、KLF4过表达组的管腔形成数量增
多（P<0.01），以及与KLF4敲低组比较，囊泡组、KLF4过表达组的管腔形成数量增多（P<0.01）；ELISA
结果显示，与对照组比较，囊泡组IL⁃1α、IL⁃6、IL⁃8 表达水平降低（P<0.01），与KLF4 敲低组比较，
KLF4过表达组IL⁃1α、IL⁃6、IL⁃8表达水平降低（P<0.01），而对照组与KLF4敲低组及囊泡组与KLF4过
表达组IL⁃1α、IL⁃6、IL⁃8表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）；qRT⁃PCR结果显示，与对照组比较，
囊泡组衰老标志物的mRNA相对表达水平降低（P<0.01），以及与KLF4敲低组比较，KLF4过表达组
衰老标志物的mRNA相对表达水平降低（P<0.01），而对照组与KLF4敲低组及囊泡组与KLF4过表达
组衰老标志物的mRNA相对表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。双荧光素酶报告基因实验结果
显示，KLF4与VEGFA存在相互作用关系。 结论 tdDPC⁃EV可抑制内皮细胞衰老并增强血管重建能力，进而提高糖尿病小鼠创面愈合质量，其机制依赖于对KLF4/VEGFA通路的上调。
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