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| 含肾上腺素α2受体激动剂和惰性气体的改良威斯康星大学保存液对大鼠离体断肢骨骼肌的保护效果 |
| 薛正威 秦志刚 刘祥凤 黎洁钰 江玲 李潇 马剑波 刘冠磊 郑鹏飞 唐颖 李鹏 顾健腾 |
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摘要 目的 构建含肾上腺素α2受体激动剂（右美托咪定）和惰性气体（氩气）的改良威斯康星大学保存液（UW液），探讨其对大鼠离体断肢骨骼肌的保护效果。方法 选取60只雄性SD大鼠构建后肢低温冷藏/灌注模型，按随机数字表法分为空白对照组、低温冷藏组、UW液灌注组、改良UW液灌注组，每组15只；同步构建大鼠骨骼肌成肌细胞（L6）冷保存模型，同样分为上述4组。动物模型处理：空白对照组后肢无特殊处理；低温冷藏组离断后肢置于4℃干燥离心管冷藏18 h；UW液灌注组离断后肢经UW液灌注后，置于含UW液的离心管4℃冷藏18 h；改良UW液灌注组离断后肢经改良UW液（含0.1 nmol/L右美托咪定+体积分数50%氩气）灌注后，置于含改良UW液的离心管4℃冷藏18 h。细胞模型处理：对应前述组别，空白对照组L6细胞正常培养；低温冷藏组、UW液灌注组L6细胞分别用常规培养基、UW液处理后，置于氮气密封袋4℃冷藏8 h再复温培养6 h；改良UW液灌注组L6细胞用改良UW液处理后，置于氩气密封袋4℃冷藏8 h再复温培养6 h。取材后，采用HE染色、湿干比称重、透射电镜分别检测骨骼肌形态结构、组织水肿、超微结构情况；光镜下观察L6细胞形态；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测L6细胞活力［以吸光度（A）值表示］；免疫荧光染色检测骨骼肌组织谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）蛋白表达水平；Western blot检测L6细胞中GPX4蛋白表达水平。结果 大鼠离体断肢保存18 h后得到如下结果：（1）HE染色结果显示，改良UW液灌注组肌纤维形态接近空白对照组，骨骼肌细胞面积占比高于低温冷藏组和UW液灌注组（P<0.05）。（2）湿干比测定结果显示，改良UW液灌注组与空白对照组、UW液灌注组差异均无统计学意义（P>0.05），3组均低于低温冷藏组（P<0.05）。（3）透射电镜结果显示，改良UW液灌注组肌纤维直径、肌小节长度、线粒体短轴/长轴比值、线粒体嵴数量等超微结构指标与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），均优于低温冷藏组和UW液灌注组（P<0.05）。（4）L6细胞形态学观察结果显示，改良UW液灌注组细胞形态规整，接近空白对照组，而低温冷藏组细胞损伤严重，UW液灌注组细胞数量减少且部分损伤。细胞活力A 值排序：空白对照组>改良UW液灌注组>UW液灌注组>低温冷藏组，4组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（5）免疫荧光染色结果显示，改良UW液灌注组GPX4蛋白荧光强度与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），均高于低温冷藏组和UW液灌注组（P<0.05）。Western blot分析结果显示，改良UW液灌注组GPX4蛋白表达水平较空白对照组降低（P<0.05），但高于低温冷藏组和UW液灌注组（P<0.05）。结论 改良UW液可通过稳定GPX4蛋白表达水平抑制铁死亡，减轻大鼠离体断肢骨骼肌组织与L6细胞冷保存损伤。
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