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摘要 目的 探究A型肉毒毒素（BTX‑A）联合静态渐进性牵伸（SPS）治疗大鼠创伤性膝关节僵硬的效果及其机制。
方法 选取40只8周龄、体重220~300 g的健康雄性SD大鼠，按随机数字表法分为空白对照组（8只）和造模组（包括损伤组、BTX‑A组、SPS组和BTX‑A+SPS组，每组7只）。根据Hlidebrand的方法建立创伤性膝关节僵硬模型，主要步骤包括破坏关节囊、克氏针固定、关节打孔和4周后取出内固定。空白对照组不做任何处理，在笼中自由活动；损伤组在造模成功后自由活动；BTX‑A组在内固定取出当天于关节腔内注射BTX‑A；SPS组在内固定取出当天开始SPS治疗；BTX‑A+SPS组在内固定取出当天于关节腔内注射BTX‑A并开始SPS治疗。治疗周期为16 d。在治疗前及治疗后16 d检测关节活动度（ROM）和关节刚度；在治疗后16 d采集大鼠膝关节组织标本并处死大鼠，采用HE和Masson染色观察关节囊纤维组织增生情况，Western blot测定磷酸化（p）‑Smad2、Smad2、p‑Smad 3、Smad 3、Smad4、转化生长因子‑β1（TGF‑β1）、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、α‑平滑肌动蛋白（α‑SMA）表达水平，再通过计算磷酸化蛋白与总蛋白的比值反映磷酸化水平。
结果 （1）ROM：治疗前，空白对照组ROM显著高于其余各组（P<0. 05），其余各组间ROM差异均无统计学意义（P>0. 05）；治疗后16 d，损伤组、BTX‑A组、SPS组和BTX‑A+SPS组ROM均低于空白对照组（P<0. 05）；BTX‑A+SPS组ROM较损伤组、BTX‑A组和SPS组均增加（P<0. 05）。治疗后16 d，空白对照组治疗前后ROM差异无统计学意义（P>0. 05），其余各组ROM较治疗前均显著增加（P<0. 01）。（2）关节刚度：治疗后16 d，损伤组、BTX‑A组和SPS组关节刚度分别为（0. 95±0. 24）N·cm/°、 （0. 86±0. 22）N·cm/°、 （0. 65±0. 09）N·cm/°，均低于空白对照组的（0. 36±0. 03）N·cm/°（P<0. 05）；BTX‑A+SPS组关节刚度为（0. 49±0. 04）N·cm/°，与空白对照组差异无统计学意义（P>0. 05），但较损伤组、BTX‑A组和SPS组均降低（P<0. 05）。（3）纤维组织增生情况：治疗后16 d，空白对照组关节囊结构完整、清晰，纤维排列有序，未见明显纤维组织增生；损伤组病理变化最严重，滑膜纤维组织大量增生，组织内血管明显增多，炎性细胞浸润；BTX‑A+SPS组较SPS组和BTX‑A组病变减轻，仅有轻度滑膜细胞增多，未见明显血管增生或淋巴细胞，总体病变最轻。（4）蛋白表达水平：治疗后 16 d，损伤组、BTX‑A 组和 SPS 组 p‑Smad2/Smad2 比值分别为1. 552±0. 234、1. 328±0. 272、1. 194±0. 277，均高于空白对照组的 0. 794±0. 082（P<0. 05）；而 BTX‑A+SPS组p‑Smad2/Smad2比值为1. 013±0. 123，与空白对照组、BTX‑A组和SPS组差异均无统计学意义（P>0. 05），较损伤组降低（P<0. 05）。治疗后16 d，损伤组、BTX‑A组、SPS组和BTX‑A+SPS组p‑Smad3/Smad3 比值分别为 2. 272±0. 309、1. 664±0. 285、1. 381±0. 276、1. 003±0. 060，均高于空白对照组的0. 515±0. 051（P<0. 05）；BTX‑A+SPS组 p‑Smad3/Smad3比值较损伤组、BTX‑A 组和 SPS组均降低（P<0. 05）。治疗后16 d，损伤组Smad4水平为1. 001±0. 015，高于空白对照组的0. 294±0. 076（P<0. 05），而 BTX‑A组（0. 664±0. 051）、SPS组（0. 833±0. 045）和 BTX‑A+SPS组（0. 467±0. 068）与空白对照组差异均无统计学意义（P>0. 05）；BTX‑A+SPS 组 Smad4 水平较损伤组、BTX‑A 组和 SPS 组均降低（P<0. 05）。治疗后16 d，损伤组TGF‑β1水平为1. 004±0. 407，高于空白对照组的0. 269±0. 122（P<0. 05），而 BTX‑A组（0. 564±0. 194）、SPS组（0. 422±0. 086）和 BTX‑A+SPS组（0. 347±0. 161）与空白对照组差异均无统计学意义（P>0. 05）；BTX‑A+SPS 组 TGF‑β1 水平较损伤组、BTX‑A 组和 SPS 组均降低（P<0. 05）。治疗后16 d，损伤组Ⅰ型胶原蛋白水平为0. 999±0.170，高于空白对照组的0. 299±0. 139（P<0. 05）；而 BTX‑A 组（0. 542±0. 278）、SPS组（0.561±0.165）和 BTX‑A+SPS组（0. 537±0. 045）与空白对照组差异均无统计学意义（P>0. 05）；BTX‑A+SPS组Ⅰ型胶原蛋白水平较损伤组、BTX‑A组和SPS组均降低（P<0. 05）。治疗后16 d，损伤组Ⅲ型胶原蛋白水平为1. 002±0. 126，高于空白对照组的0. 239±0. 106（P<0. 05），而 BTX‑A 组（0. 661±0. 062）、SPS组（0. 595±0. 062）和 BTX‑A+SPS 组（0. 504±0. 269）与空白对照组差异均无统计学意义（P>0. 05）；BTX‑A+SPS组Ⅲ型胶原蛋白水平较损伤组、BTX‑A组和 SPS 组均降低（P<0. 05）。治疗后 16 d，损伤组 α‑SMA 水平为 0. 998±0. 074，高于空白对照组的0. 130±0. 023（P<0. 05），而 BTX‑A组（0. 358±0. 060）、SPS组（0. 432±0. 230）和 BTX‑A+SPS组（0. 293±0. 135）与空白对照组差异均无统计学意义（P>0. 05）；BTX‑A+SPS组α‑SMA水平较损伤组、BTX‑A组和SPS组均降低（P<0. 05）。
结论 与单一治疗相比，BTX‑A联合SPS治疗大鼠创伤性膝关节僵硬，在改善关节活动度和关节弹性、抑制关节囊纤维增生方面更具优势；其可能机制是通过进一步抑制关节囊TGF‑β1的表达来降低Smad2和Smad3的磷酸化水平，阻止其与Smad4受体结合，进而降低TGF‑β/Smad信号通路中下游蛋白质如Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和α‑SMA的表达。
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